細(xì)胞處理：

MEF 細(xì)胞鋪制：

1. 在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養(yǎng)液。一般地，一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF 完全培養(yǎng)液。

3.  按實(shí)驗(yàn)需要：小鼠胚胎干細(xì)胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復(fù)蘇 MEF 細(xì)胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF 完全培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心 5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF 完全培養(yǎng)液 1 ml，重懸后按照一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶鋪 1′10^6 的 MEF 細(xì)胞，平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞。

5.復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細(xì)胞前，將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF 完全培養(yǎng)液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液待用。

復(fù)蘇：

1.將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi)，以 1000 rpm，離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 2 ml，吹打懸浮。

4. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。

5.  轉(zhuǎn)移至 1 個(gè)已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。

傳代：

1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化。

7.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，多次輕輕吹打細(xì)胞， 制成單細(xì)胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地，一個(gè) T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。

2.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。

3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。

4．將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方：

小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液 60%，ES 級(jí) FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞分離的簡(jiǎn)易方法（差速貼壁法）：

1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞， 吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個(gè)T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在一個(gè) 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞）中。

2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時(shí)。

3.  1 小時(shí)后，絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。